Frühzeitige Detektion von viraler DNA und RNA

01.03.2018
Unsere Mitarbeiter

PCR-Methoden (Polymerasekettenreaktion) detektieren virale Nukleinsäuren bereits sehr frühzeitig nach der Infektion und können deshalb auch Spender identifizieren, die noch keine Antikörper gebildet haben.

Zum Beispiel ist das Hepatitis C Virus (HCV) mithilfe einer PCR bereits ungefähr 1–2 Wochen nach der Infektion detektierbar, wohingegen der HCV-Antikörperspiegel, der die Antwort des Immunsystems auf die Infektion darstellt, auch bis zu zwei Monate nach der Infektion nicht erfassbar sein kann. Das ist das sogenannte „diagnostische Fenster“ während dem ein neuinfizierter Spender nicht mit herkömmlichen Antikörpersuchtests erkennbar ist.
Vor der Aufbereitung der Minipools werden die Plasmaproben in Gestelle gelegt, um ein automatisches Entkappen und Poolen zu ermöglichen.

Die PCR ist eine NAT-basierte Methode, wobei NAT (Nucleic Acid Amplification Test) für ein Diagnoseverfahren steht, bei dem gezielt genetisches Material vervielfältigt wird, um es dann nachzuweisen. Dazu werden zunächst zwei sehr kurze DNA Moleküle (Primer) benutzt, um an einen kleinen, aber spezifischen Teil des viralen Genoms Desoxyribonukleinsäure (DNA) oder Ribonukleinsäure (RNA) zu binden. Wenn die Bindungsstellen für die Primer vorhanden sind, wird ein spezifischer Bereich mithilfe eines Enzyms in mehreren Schritten stark vervielfältigt. Sobald dieser kleine Zielbereich vervielfältigt wurde, sendet eine dritte Komponente der PCR-Reaktion (die Sonde) ein Signal aus, das von dem PCR-Analysegerät detektiert werden kann.

Alle Plasmaeinheiten werden zum Zeitpunkt der Spende mit Antikörper-/Antigen-basierten Methoden auf das humane Immundefizienz-Virus (HIV), Hepatitis-C-Virus (HCV) und Hepatitis-B-Virus (HBV) getestet. Anschließend werden alle Spenden mittels PCR in Minipools auf HIV, HCV, HBV, HAV, Parvovirus B19 (B19V) und, wenn erforderlich, auch auf Hepatitis E (HEV) getestet. Plasma aus den USA wird, bedingt durch die FDA-Regularien, bereits in den USA getestet. Für alle anderen Plasmaspenden, die nicht bereits von einem anderen externen Labor komplett mittels PCR getestet wurden, wird diese Testung bei uns in Stockholm durchgeführt. Unser zentrales PCR-Labor leitet die Ergebnisse der individuellen PCRs dann an alle Octapharma-Produktionsstätten weiter. Das Testen von Plasmapools aus der Produktion unserer Präparate entsprechend den Vorgaben der Europäischen Pharmakopöe erfolgt entweder hier in Stockholm oder im Octapharma PCR-Labor in Frankfurt.

In Europa sind Minipool-Tests keine regulatorische Anforderung, sondern eine interne Strategie von uns, um das Risiko der Kontamination eines gesamten Plasmapools für die Produktion zu minimieren, da das eine enorme Verschwendung des Rohstoffs wäre und auch den Verlust des Endprodukts für den Patienten bedeuten würde. Minipool-Tests reduzieren die Anzahl der Proben, die analysiert werden müssen. Anstatt 480 einzelne Plasmaproben zu untersuchen, wird ein „480-Spenden umfassender Minipool“ hergestellt, der ein kleines Volumen von jeder dieser 480 Proben enthält. Dieser Minipool wird auf das Vorhandensein von Viren mittels PCR untersucht. Wenn ein PCR-Ergebnis positiv ausfällt, wird bis zur einzelnen Plasmaspende zurück getestet, sodass die Plasmaeinheit, die das Virus enthält, identifiziert und dem weiteren Produktionsprozess entzogen wird.

Unser PCR-Labor in Stockholm besteht aus drei Gruppen: dem PCR-Pooling Team, welches die Minipools der Plasmaproben durchführt, dem PCR-Analyse-Team, welches die Routine-PCR-Analysen der Minipool-Proben und auch der Plasma-Pool-Proben durchführt und meinem Team, dem PCR-Forschungs- und Entwicklungs- (PCR-F&E) und PCR-Supportbereich. Dieses entwickelt, validiert, implementiert und unterstützt die Anwendung der in Stockholm verwendeten PCR-Methoden. Diese drei Teams arbeiten sowohl parallel als auch zusammen als Teil eines Arbeitsablaufs.

Durch die Arbeit in unserem PCR-Labor sind wir mitten im Geschehen vieler interessanter Fragestellungen und es ist toll, Teil eines Teams zu sein, das regulatorischen Einfluss hat.

Die Barcodes aller Plasmaproben werden gescannt, bevor der Minipool-Prozess gestartet wird, und die Identitäten werden innerhalb des LIMS-PCRSystems verwaltet, in dem auch die Zuordnung zwischen der einzelnen Probe und dem entsprechenden Minipool erfolgt.
Die PCR-Pooling-Labor

Ein typischer Tag im PCR-Pooling-Labor beginnt damit, dass die PCR-Proben, welche am Tag zuvor angekommen sind, aus dem Kühlraum herausgenommen werden, in dem sie aufgetaut wurden. Die Probenröhrchen werden in ein Gestell gelegt, die Deckel geöffnet und in die MinipoolRoboter gesetzt – jeweils 480 Proben auf einmal. Die Roboter saugen dann ein kleines Volumen von jeder Probe auf, verteilen dieses auf 96-Well Mikrotiterplatten und auf ein weiteres Röhrchen, das 96-Pool-Röhrchen. Kleine Mengen von allen 480 Proben werden dabei auf die fünf 96-Pools und die jeweiligen Mikrotiterplatten verteilt. Danach wird noch ein weiterer Pool erstellt, indem eine kleine Menge aus jeder der fünf 96-Pool-Proben in ein Röhrchen gemischt wird, so dass ein Minipool entsteht, der Teile aus allen 480 Proben enthält. Die Barcode-Identitäten aller Röhrchen und Mikrotiterplatten sind hierarchisch im LaborInformations- und Management-System (LIMS)- PCR-System abgebildet Dies ist eine spezialisierte LIMS-Plattform, die für die Bearbeitung der komplexen Minipools entwickelt wurde. Ungefähr 10–20 Minipool-Durchläufe werden pro Tag durchgeführt, was ca. 5.000–10.000 einzelnen Plasmaproben entspricht.


PCR-Analyselabor

Für diese Proben führt das PCR-Analyselabor zunächst die Nukleinsäureextraktion und dann die PCR-Analysen auf HIV, Hepatitis C (HCV), Hepatitis B (HBV), Hepatitis A (HAV), Parvovirus B19 (B19V) und, wenn erforderlich, auch Hepatitis E (HEV) durch. Täglich werden 10–60 Minipools komplett mit 5–6 PCR-Methoden analysiert. Dazu kommen pro Woche noch ca. 10–15 Plasmapools aus der Produktion.

PCR-F&E und PCR-Supportbereich

Das Team des PCR-F&E und Supportbereichs bietet dem PCR-Analyse-Team Unterstützung bei der Methodik, der Interpretation komplexer Ergebnisse, der wissenschaftlichen Beratung und bei Fragen zur Virussicherheit und Kontamination, sowie bei dem Reporting von PCR-Ergebnissen. Die F&E-Aktivitäten in meinem Team umfassen hauptsächlich die Entwicklung neuer PCR-Methoden für die Detektion verschiedener Pathogene, sowohl im Plasma und Serum als auch in anderen Proben. Die analytischen Methoden müssen von Zeit zu Zeit angepasst werden, z. B. um neuen gesetzlichen Anforderungen zu entsprechen, um neuere Versionen eines Geräts zu nutzen oder um einen höheren Automatisierungsgrad zu erreichen. Nachdem eine neue Methode entwickelt wurde, wird diese gemäß den aktuellen Richtlinien validiert, d.h. auf mehrere vordefinierte Parameter unter strengen Auflagen getestet. Dazu gehört z. B. die Festlegung der analytischen Sensitivität, die Bewertung der Robustheit der Methode oder ob alle relevanten Genotypen detektiert werden können. Wenn die Methode die vordefinierten Anforderungen erfüllt, wird die Validierung zuerst intern genehmigt. Doch bevor eine Methode implementiert werden kann, muss diese von unserer internationalen Abteilung für Arzneimittelzulassung (IDRA - International Drug Regulatory Affairs) auf regulatorische Auswirkungen hin beurteilt werden. Wenn notwendig, bereiten wir die Dokumente für die Einreichung bei der Behörde vor. Sobald die Zulassung erteilt wird – was normalerweise innerhalb eines Jahres geschieht – führen wir die Methode im PCR-Analyse-Team für Routinetests von Minipools und Plasmapools ein. All diese Vorgänge werden in einem „Change Control“ System abgewickelt, um eine ordnungsgemäße Dokumentation, Bewertung, Verantwortlichkeiten und Nachverfolgbarkeit zu gewährleisten.

Die Arbeit des PCR-F&E und Supportteams ist kreativ und oft sehr abwechslungsreich, mit vielen lebhaften Diskussionen. Die gleiche Neugierde, die mich dazu gebracht hat, eine Karriere in der Wissenschaft einzuschlagen, treibt mich auch hier bei der Arbeit an. Es gibt eine grundlegende Neugierde in mir, die mich dazu motiviert, neue Methoden zu erforschen und Wege zu finden, um diese zu optimieren. Ich genieße die Vielseitigkeit meiner Arbeit: An einem Tag diskutiere ich mit meinem Team über die spezifischsten Einzelheiten des HCV-Genoms und am nächstem Tag bin ich in eine Diskussion mit mehreren Standorten über die Interpretation der HIV-Serologie verwickelt.

Durch die Arbeit in unserem PCR-Labor sind wir mitten im Geschehen vieler interessanter Fragestellungen und es ist toll, Teil eines Teams zu sein, das regulatorischen Einfluss hat. Meine Philosophie ist: Respektiere den Spender und den Patienten. Jede Plasmaspende ist wichtig und dank einer kontinuierlich qualitativ hochwertigen Plasmaversorgung, sowie einer Qualitätsorganisation können wir Patienten auf der ganzen Welt eine sichere, effiziente und in vielen Fällen lebensrettende Behandlung anbieten.

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